Пројекат Опен Антибодиес је глобална истраживачка сарадња коју заједнички промовишу УЦ Давис, НИХ НеуроМаб Фацилити, ДСХБ и Аддгене. Циљ му је да реши кризу репродуктивности антитела кроз стандардизацију, транспарентност и отворено дељење. Њена имплементација није лабава иницијатива, већ процес инжењеринга у шест- корака који је извршан, подложан ревизији и поновљив.
1. Стандардизовано стицање и достављање секвенци гена антитела
Извор: антиген{0}}специфичне Б ћелије су изоловане од имунизованих животиња или опорављених пацијената коришћењем технологије сортирања појединачних Б ћелија (као што је ФАЦС). БЦР мРНА се екстрахује и амплифицира помоћу РТ-ПЦР-а да би се добиле комплетне В(Д)Ј секвенце тешких и лаких ланаца.
Захтеви за формат: Секвенца мора да буде у ФАСТА формату и да садржи напомене за фрагменте гена В, Д и Ј.
Информације о имуногену (име антигена, врста, поступак имунизације) морају бити укључене.
Мора се навести порекло клонирања (нпр. „донор човека #27, после-САРС-инфекције ЦоВ-2“).
Платформа за подношење: Пошаљите необрађене податке о секвенци преко Аддгене обрасца „Предложи плазмид“.
Кључне тачке: Секвенца мора бити ген рекомбинантног антитела; забрањено је подношење несеквенционих антитела добијених из хибридома.
2. Конструкција плазмида и пројектовани склоп вектора експресије
Селекција вектора: Користите стандардне векторе експресије сисара (нпр. пЦМВ или пЕФ1), обезбеђујући укључивање ИгГ1 Фц константног региона и Козак секвенце.
Метода клонирања: Користите Гибсонов склоп или клонирање Голден Гате-а да бисте постигли природно упаривање тешких и лаких ланаца, избегавајући насумичне комбинације.
Конвенције о именовању плазмида:
ОпенАб_[Антиген]_[Специес]_[ЦлонеИД]_в1
Пример: ОпенАб_САРС2_Спике_ху_047_в1
3. Подношење и преглед преко Аддгене платформе
Унос за подношење: Приступите обрасцу Аддгене Суггест а Пласмид
Критеријуми прегледа: секвенца без контаминације и мутација померања оквира; Плазмид садржи комплетан промотер и терминатор; Наведите мапу плазмида (.гб датотека)
Време прегледа: Обично 7–14 радних дана. Након одобрења, Аддгене ИД (нпр. #123456) се додељује и плазмид се јавно додаје у базу података.
Исход: Плазмид постаје глобално претражив ресурс, доступан бесплатно сваком истраживачу.
4. Стандардизовано генерисање и отпремање података о валидацији
Методе валидације: Морају бити у складу са пет стубова ИВГАВ-а (Међународна радна група за валидацију антитела):
|
Валидатион Типе |
Метод |
Захтеви |
|
Генетска валидација |
ЦРИСПР нокаут/нокдаун циљног протеина |
Нестанак или значајно смањење ВБ опсега |
|
Ортогонална валидација |
Поређење са масеном спектрометријом или резултатима РНК{0}}секвенције |
Доследан образац изражавања |
|
Независна валидација антитела |
Унакрсна{0}}валидација коришћењем антитела са различитим епитопима |
Конзистентни резултати |
|
Функционална валидација |
Тест неутрализације, проточна цитометрија |
Показује очекивану биолошку функцију |
|
Валидација апликације |
ИХЦ, ИФ, ВБ, ФЦ |
Специфично бојење за циљну примену |
Формат података:
ИХЦ/ИФ слике: Морају укључивати негативну контролу (кино за избацивање) и позитивну контролу.
ВБ слике: Морају да садрже маркере молекулске тежине и интерне контроле (нпр. -актин).
Све слике морају бити постављене у ТИФФ формату без губитака, заједно са експерименталним параметрима (однос разблажења антитела, време експозиције).
Обавезни захтев: Сви подаци о валидацији морају бити објављени заједно са плазмидима; ни једно ни друго није неопходно.
5. Глобална бесплатна дистрибуција и употреба
Метод приступа:
Посетите колекцију плазмида антитела Аддгене
Потражите циљно антитело (нпр. "ОпенАб_САРС2_Спике")
Пошаљите{0}}Уговор о некомерцијалној употреби (није потребно плаћање)
Примите плазмид (обично 5-10 радних дана)
Смернице за употребу:
Аддгене ИД и изворни извор секвенце морају бити цитирани у раду.
Подстакните слање нових података о валидацији назад у Аддгене да бисте формирали екосистем затворене{0}}петље.
6. Континуирана повратна информација и итерација екосистема
Механизам повратне информације о подацима: Корисници постављају нове експерименталне резултате (нпр. нове апликације, реактивност нових врста) на платформу Аддгене, формирајући базу података динамичке валидације.
Управљање заједницом: ДСХБ и НИХ редовно објављују извештаје о квалитету антитела, елиминишући неефикасна или унакрсно{0}}реактивна антитела.
Резултати: Од 2025. године, 89% истраживања која користе антитела отвореног{2}}извора могу се независно репродуковати, што је далеко више од 45% за комерцијална антитела.
